Dòng vi khuẩn ức chế virus gây bệnh đốm trắng trên tôm thẻ

Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) lây nhiễm trên nhiều loài giáp xác theo cả chiều ngang (qua môi trường nước và vật mang mầm bệnh) và theo chiều dọc (từ tôm mẹ nhiễm bệnh sang tôm con trong các trại sản xuất giống). WSSV không lây từ mẹ sang trứng nhưng chúng thải virus đốm trắng trong môi trường nước và lây nhiễm cho ấu trùng.

Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học sàng lọc và lựa chọn các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế virus WSSV gây bệnh đốm trắng và vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tác nhân chính gây bệnh hoại tử gan tụy AHPND trên tôm thẻ chân trắng. 

Phân lập nguồn vi khuẩn Bacillus sp:

Vi khuẩn được phân lập từ các nguồn khác nhau như các sản phẩm thực phẩm lên men (bột đậu nành và kim chi), ruột tôm, ruột mực, nước ngập mặn, trầm tích, và nước biển được cấy trên môi trường (TSA) chứa 3% NaCl, pH 7,2 được ủ ở nhiệt độ 37 ° C trong 2 ngày. Tổng cộng có 173 chủng vi khuẩn được phân lập.

Nghiên cứu xác định hoạt tính kháng khuẩn:

Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. V. parahaemolyticus được nuôi trong môi trường dinh dưỡng chứa 3% NaCl, trong 24 giờ. Sau đó, lấy 50 µl vi khuẩn V. parahaemolyticus có mật độ 2 × 107 cfu/ml cho vào đĩa thạch và dàn đều trên mặt thạch bằng que trải vi khuẩn, để khô tự nhiên. Một đĩa giấy 8 mm được đặt trên đĩa thạch, dùng pipet lấy 50μL của chủng vi khuẩn phân lập (mật độ tế bào 2 × 108) được thả vào đĩa giấy và ủ ở 30 ° C. Sau 48 giờ đọc kết quả, khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn được xác định bằng vòng kháng xung quanh đĩa giấy.

Kết quả: Vi khuẩn B. subtilis KA1 có khả năng kháng lại vi khuẩn V. parahaemolyticus  với vòng tròn vô khuẩn 4mm trong khi vi khuẩn B. subtilis KA3 kháng lại vi khuẩn V. parahaemolyticus thấp hơn với vòng vô khuẩn 1mm.

Bổ sung vi khuẩn giúp tôm vượt qua thách thức WSSV

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành với 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 25 con/bể với trọng lượng 6gr/con.

Nghiệm thức 1: đối chứng L. vannamei không bị nhiễm WSSV

Nghiệm thức 2: Tôm bị nhiễm WSSV

Nghiệm thức 3: B. subtilis KA1 + WSSV

Nghiệm thức 4: B. subtilis KA3 + WSSV

Tôm thẻ chân trắng sẻ được thuần 2- 3 ngày. Sau đó, 0.1% (với mật độ tế bào 2 × 108) vi khuẩn B. subtilis phân lập được cấy vào bể nuôi. Sau 2 ngày, 0.01% WSSV được thêm trực tiếp vào bể và tiến hành quan sát tỉ lệ chết, tôm chết được kiểm tra bằng PCR để xác nhận nhiễm WSSV.

Kết quả: 

Sau 20 ngày thí nghiệm, nghiệm thức 3 bổ sung B. subtilis KA1 tôm có tỉ lệ sống cao nhất 84% khi bị thử thách với WSSV, nghiệm thức 4 đạt tỷ lệ sống 60%, trong khi đó, nghiệm thức 2 tôm bị nhiễm WSSV nhưng không bổ sung vi khuẩn B. subtilis thì tất cả tôm đều chết (tỉ lệ sống 0%). Ba chủng vi khuẩn được tái phân lập và được xác định bằng trình tự gen 16S rRNA, là B. subtilis KA1 (1491 bp) và B. subtilis KA3 (1492 bp). B. subtilis KA1 cũng đã trải qua một loạt các xét nghiệm sinh hóa. Với 97,1% kết quả xác nhận phân lập được là B. subtilis.

Tốc độ tăng trưởng của tôm sau khi thí nghiệm cho thấy nghiệm thức 3 bổ sung B. subtilis KA1 cao nhất. Tương tự với nghiên cứu của Rengpipat et al., 1998 báo cáo rằng chủng Bacillus S11 tạo ra năng suất tốt hơn, kiểm soát các bệnh và cải thiện khả năng miễn dịch ở tôm sú Penaeus monodon.

Trong số các chủng phân lập, B. subtilis KA1 tạo ra men protease và lipase có hoạt động cao nhất. Những enzyme này trực tiếp thúc đẩy tiêu hóa giúp tôm tăng trưởng giảm hệ số FCR. Ngoài ra, B. subtilis sản xuất một lượng lớn các chất chuyển hóa thứ cấp như kháng sinh, hóa chất và enzyme, cũng như protein, kháng nguyên và vắc-xin kháng lại vi khuẩn Vibrio gây hại.

Ứng dụng của nghiên cứu

Các loài vi khuẩn Vibrio là mầm bệnh cơ hội và chiếm ưu thế trong môi trường ao nuôi. Virus thường là mầm bệnh chính lây nhiễm cho tôm, trong khi nhiễm đó vi khuẩn bội nhiễm sẻ làm tăng tốc độ chết của tôm. Việc bổ sung Probiotic vào thức ăn tôm giúp tăng cường hệ vi sinh đường ruột kháng lại vi khuẩn gây bệnh. Nghiên cứu này là cơ sở cho việc chọn lọc và phát triển dòng vi khuẩn giúp tôm vượt qua thách thức mầm bệnh đồng thời hạn chế việc sử dụng kháng sinh trong phòng trị một số bệnh trên tôm nuôi.

B. subtilis KA1 có khả năng kiểm soát virus WSSV và vi khuẩn V. parahaemolyticus. Đồng thời B. subtilis KA1 có khả năng sản sinh protease và lipase tăng tiêu hóa thức ăn. Do đó, B. subtilis KA1 thu được từ nghiên cứu này cho thấy tiềm năng mạnh mẽ để ứng dụng làm men vi sinh trong nuôi tôm thẻ.

Nhóm nghiên cứu: Rengpipat S., Phianphak W., Piyatiratitivorakul S., Menasveta